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Identification des phoshorylations impliquées dans la régulation de l'activité du récepteur NPFF2

Post on 26 February 2015

Lauriane Bray: defense in November 21st, 2014

L’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) induit la phosphorylation de résidus Serine (S) et Thréonine (T) dans les domaines intracellulaires des récepteurs. Ces phosphorylations sont impliquées dans la désensibilisation du récepteur, son internalisation mais aussi dans le choix de la voie de signalisation activée.

Le neuropeptide FF appartient à une famille de neuropeptides impliqués dans la modulation de l’activité analgésique des opioïdes en activant le récepteur NPFF2, un récepteur couplé aux protéines Gi. Il inhibe l’adénylyl cyclase, active la voie des MAP Kinases et la libération de calcium intracellulaire. Afin d’étudier le rôle des phosphorylations induites par l’agoniste dans la régulation de l’activité du récepteur, nous avons déterminé par spectrométrie de masse le profil de phosphorylation des récepteurs humain et de rat exprimé dans les cellules SH-SY5Y. Les phosphorylations ont été identifiées dans l’extrémité C-terminale (T372/S373, S382, S386, S395, T412 et S414/T415). La phosphorylation in vitro du fragment C-terminal du récepteur humain par la GRK2 a permis d’identifier le cluster 414TTNSS418 comme substrat de la kinase. Les sites conservés entre espèces (TS372AA, S395A, TNST412ANAA, ST414AA) ainsi que les sites spécifiques au rat (S382A/S386A) ont été remplacés par des alanines et les récepteurs de rat mutés transfectés dans des cellules SH-SY5Y. Leurs propriétés de liaison, signalisation, désensibilisation et internalisation ont ensuite été comparées au récepteur sauvage (WT).

Aucune des mutations réalisées n’affecte la capacité du récepteur à inhiber l’adénylyl cyclase excepté la mutation des résidus rat-spécifiques. Ce qui suggère un rôle de ces résidus dans l’efficacité du couplage à la protéine G. Chacun des récepteurs mutés active la voie des MAPK de façon comparable au WT. L’activation de cette voie est donc indépendante de la phosphorylation des sites mutés.

La libération de calcium intracellulaire induite par activation du récepteur a été examinée par imagerie calcique. Une diminution de la désensibilisation a été observée pour trois des récepteurs mutants: TS372AA, ST414AA et TNST412ANAA.

Le rôle des phosphorylations dans l’internalisation du récepteur après stimulation par l’agoniste 1DMe a été évalué par immunocytochimie. L’internalisation des récepteurs S395A, ST414AA et TNST412ANAA est diminuée par rapport au WT. Ces sites de phosphorylation sont donc impliqués dans le trafic intracellulaire du récepteur. Pourtant, ces récepteurs restent capables de recruter la -arrestine-GFP, probablement avec une efficacité moindre.

La phosphorylation des résidus T372, T414 et T415 a été confirmée par Western Blot comme étant induite par liaison du 1DMe. La phosphorylation du récepteur WT est diminuée après traitement à la toxine pertussique et/ou à l’inhibiteur ARK1, montrant le rôle de Gi et de la GRK2 dans la phosphorylation du récepteur.

Parallèlement à ce travail, afin de produire de nouveaux outils pour l’étude du récepteur NPFF 2, nous avons caractérisé un ligand peptidique : le YE(Bpa)WSLAAPQRFNH2. Ce ligand iodable se lie au récepteur avec une haute affinité et de façon irréversible après irradiation aux UV.

Cette étude a permis d’identifier par spectrométrie de masse et Western Blot les résidus phosphorylés suite à l’activation du récepteur NPFF2 par l’agoniste ainsi qu’une des kinases impliquées. Les études fonctionnelles réalisées après mutagénèse montrent l’implication du résidu S395 et du cluster TNST412 dans l’internalisation du récepteur, des résidus TS372 et du cluster TNST412 dans sa désensibilisation. Aucun des sites conservés, mutés ne joue de rôle dans la signalisation du récepteur, alors que les sites rat-spécifiques semblent jouer un rôle dans l’efficacité du couplage à la protéine G.

Ces résultats apportent une nouvelle preuve du rôle spécifique de la phosphorylation de résidus particuliers dans la régulation de l’activité des RCPG et permettent d’envisager la production d’anticorps phosphospécifiques destinés à l’étude in vivo de l’activation du récepteur NPFF2.